桂芍鎮(zhèn)癇片主要成份有桂枝、白芍、黨參、半夏(制)、柴胡、黃芩、甘草、生姜、大棗。那么，桂芍鎮(zhèn)癇片的含量怎么測定呢？

原質量標準中只有黃芩、白芍的鑒別,無含量測定。為了好地控制本品質量,本試驗對其質量標準進行了研究。采用薄層色譜(TLC)法對制劑中的甘草、黨參及柴胡進行了鑒別,采用液相色譜(HPLC)法對制劑中君藥白芍的主要成分芍藥苷進行了含量測定。

1儀器與試藥

LC-20AT液相色譜儀,包括SPD-20A檢測器、Labsolution色譜數(shù)據(jù)處理工作站(日本島津)；賽多利斯電子天平(1/100000,德國)；KQ-250DE數(shù)控型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

甘草次酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號110723-200411)；黨參對照藥材(供鑒別用,中國藥品生物制品檢定所,批號121057-200303)；柴胡對照藥材(供鑒別用,中國藥品生物制品檢定所,批號120992-0301)；芍藥苷對照品(供含量測定用,中國藥品生物制品檢定所,批號110736-200423)；桂芍鎮(zhèn)癇片樣品(自制,批號060811、060812、060813)。乙腈為色譜純,水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

2定性鑒別

2.1甘草的鑒別

取本品10片,除去薄膜衣,研細,稱取細粉3g,加氯仿40mL,回流提取30min,濾過,濾渣揮干溶劑,加甲醇40mL,回流提取1h,濾過,濾液蒸干,殘渣加水30mL使溶解,用水飽和的正丁醇提取3次,每次20mL,合并正丁醇液,用正丁醇飽和的水洗滌2次,每次20mL,合并正丁醇液,蒸干,殘渣加甲醇1mL使溶解,作為供試品溶液。另取甘草次酸對照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗,吸取供試品溶液5～10μL、對照品溶液4μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(30～60℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶20∶7∶0.5)為展開劑[1],展開,取出,晾干,噴以10%磷鉬酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。

2.2黨參的鑒別

取本品10片,除去薄膜衣,研細,稱取細粉3g,加正丁醇50mL,超聲處理30min,濾過,濾液濃縮至約0.5mL,作為供試品溶液。另取黨參對照藥材2g,加水20mL,微沸煮40min,濾過,濾液用正丁醇30mL振搖提取,正丁醇液濃縮至1mL,作為對照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗,吸取供試品溶液和對照藥材溶液各5μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以正丁醇-無水乙醇-水(15∶3∶2)為展開劑[2],展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇,于105℃下加熱。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。

2.3柴胡的鑒別

取本品10片,除去薄膜衣,研細,稱取細粉3g,置具塞錐形瓶中,加甲醇50mL,超聲處理30min,濾過,濾液蒸干,殘渣加水30mL使溶解,并轉移到分液漏斗中,用水飽和的正丁醇提取3次,每次40mL,合并正丁醇液,用氨試液40mL洗滌,棄去氨液,正丁醇層蒸干,殘渣加甲醇1mL使溶解,作為供試品溶液。取柴胡對照藥材1g,加水微沸30min,濾過,濾液濃縮至約30mL,轉移至分液漏斗中,余項操作同供試品,即得對照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國藥典》2005年版(一部)附錄ⅥB]試驗,吸取供試品溶液和對照藥材溶液各10μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)為展開劑[3],展開,取出,晾干,噴以10%磷鉬酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。

3含量測定

3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱為DiamonsilTMC18(5μm,200mm×4.6mm)；流動相為乙腈-0.1%醋酸溶液(15∶85),流速為1.0mL/min；檢測波長為230nm；柱溫為室溫。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應不低于4000；分離度R＞1.5。

3.2溶液的制備

3.2.1對照品溶液

精密稱取芍藥苷對照品12.26mg,置100mL量瓶中,加甲醇適量使溶解,定容,搖勻,精密量取5.0mL,置10mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,經(jīng)0.45μm濾膜濾過,即得。

3.2.2供試品溶液

取桂芍鎮(zhèn)癇片10片,除去薄膜衣,研細,取細粉0.2g,精密稱定,置50mL量瓶中,加稀乙醇35mL,超聲處理((功率250W,頻率40kHz),放冷,加稀乙醇定容,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,經(jīng)0.45μm濾膜濾過,即得。

3.2.3陰性對照品溶液

按處方組成及制備工藝制備不含芍藥的樣品,按“3.2.2”項下方法處理,即得。

3.3空白干擾試驗

按上述色譜條件,分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液,注入液相色譜儀,測定。結果在供試品色譜中,在與對照品色譜峰相應的位置上有相同保留時間的色譜峰,而陰性對照品溶液在此無峰,見圖1。芍藥苷與其他組分分離良好,說明陰性樣品對芍藥苷含量測定無干擾。

3.4線性范圍考察

精密吸取對照品溶液4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μL,按上述色譜條件測定,記錄色譜圖,以峰面積為縱坐標,進樣量為橫坐標,進行線性回歸,得回歸方程為：Y＝1547954X＋14289(r＝0.9997)。結果表明,芍藥苷在0.2452～0.7356μg范圍內線性關系良好。

3.5精密度試驗

精密吸取對照品溶液10μL,按上述色譜條件重復進樣5次,記錄色譜圖,計算。結果RSD＝0.81%,表明本法精密度較好。

3.6穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液10μL,按上述色譜條件測定,分別于0、4、8、12、24h進樣,記錄色譜圖,測定峰面積,計算。結果RSD＝1.04%,表明供試品溶液在24h內基本穩(wěn)定。

3.7重復性試驗

取同一批樣品(批號060811)5份,按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定,記錄色譜圖,測定峰面積,計算。結果本品平均含量為13.06mg/g(RSD＝1.10%),表明本方法重復性良好。

3.8加樣回收率試驗

取已知含量的樣品(批號060811,含量13.06mg/g),除去薄膜衣,研細,取0.1g,精密稱定,置50mL量瓶中,精密加入芍藥苷對照品溶液10mL(濃度為0.1226mg/mL),其余按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定,記錄色譜圖,計算,結果見表1。本方法回收率在96.7%～100.3%之間,RSD＝1.52%,表明方法的準確性較好。

3.9樣品測定

取3個批號(060811、060812、060813)的樣品,平行2份,按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液。精密量取對照品、供試品溶液各10μL,按上述色譜條件測定,測定峰面積,計算。結果3個批號樣品中芍藥苷的平均含量分別為4.12、4.09、4.08mg/片。

4討論

曾試驗了甲醇-0.1%磷酸溶液(35∶65)、甲醇-水(30∶70)及乙腈-0.1%醋酸溶液(25∶75)等流動相系統(tǒng),結果均不理想。而流動相為乙腈-0.1%醋酸溶液(15∶85)時,具有較好的分離度和適宜的保留時間,故以此作為含量測定的流動相。

在篩選樣品中芍藥苷的提取條件時,比較了稀乙醇加熱回流法和超聲提取法,結果超聲提取方便、迅速,超聲30min即可提取完全,故樣品的處理采用超聲提取30min。

以TLC法對制劑中的甘草、黨參及柴胡進行定性鑒別,斑點清晰,專屬性好,無陰性干擾。芍藥苷為白芍中的主要成分,可用來作為中成藥中白芍的定量指標成分。所建立的HPLC法測定芍藥苷含量簡便、重復性好,可作為控制本品質量的指標。

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（實習編輯：陳廣海）

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