2010年1月至2014年12月上海兒童醫(yī)學(xué)中心PICU嬰兒膿毒癥病例130例，根據(jù)膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)分為膿毒癥組(51例)和嚴(yán)重膿毒癥組(79例)，同期健康
體檢兒童作為對照組(108例)。根據(jù)28d病死率將嚴(yán)重膿毒癥組分為生存組(45例)和死亡組(34例)兩個亞組。測定各組血清組蛋白濃度，并分析其與疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的相關(guān)性。培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)，用小牛胸腺組蛋白(calfthymushistone，CTH)以不同濃度(0、50、100、200及300μg/ml)及不同時間(200μg/mlCHT處理0、5、15、30、45、60min)處理后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞存活率，以電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，以Westernblot檢測核因子(nuclearfactor，NF)-κB及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通路中NF-κB抑制因子IκB以及磷酸化p38/p38表達(dá)，以ELISA檢測腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6表達(dá)水平。
結(jié)果
嚴(yán)重膿毒癥組患兒血清組蛋白水平(19.17&plu
smn;10.20)顯著高于膿毒癥組(2.29±1.00)及對照組(0.23±0.26)(P<0.001)，并且在嚴(yán)重膿毒癥患兒中，死亡患兒血清組蛋白水平顯著高于存活者(29.47±5.99vs.10.94±2.68，P<0.001)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨CTH處理時間或者劑量增加，HUVEC的生存率逐步下降。掃描電鏡和透射電鏡觀察CTH處理后HUVEC發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜破壞現(xiàn)象。組蛋白可以激活NF-κB及MAPK通路，并釋放腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6等炎性因子。
結(jié)論
在膿毒癥患者中胞外組蛋白濃度與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。CTH可以呈劑量依賴性及時間依賴性誘導(dǎo)HUVEC死亡。胞外組蛋白在膿毒癥中通過對
血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用，介導(dǎo)疾病進(jìn)程，而這一毒性作用與破壞內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜及激活NF-κB及MAPK信號通路有關(guān)。
膿毒癥(sepsis)是當(dāng)前重癥監(jiān)護(hù)病房所面臨的棘手難題，病死率高達(dá)18%～29%[1]。膿毒癥病理過程復(fù)雜，涉及大量細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)與凝血系統(tǒng)的激活，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的功能改變在其發(fā)病過程中起著重要作用[2]。膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克、多臟器功能不全綜合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)的發(fā)生是一個動態(tài)過程，有效地遏制膿毒癥的發(fā)展進(jìn)程，對降低膿毒性休克及MODS的發(fā)生率和病死率十分重要。
到目前為止，尚沒有一項(xiàng)可單獨(dú)用于膿毒癥患者疾病進(jìn)展和預(yù)后的評估指標(biāo)。2009年，Xu等[3]首次報(bào)道細(xì)胞外組蛋白在膿毒癥小鼠血清中的含量顯著高于正常小鼠，利用抗體中和組蛋白可以明顯抑制膿毒癥小鼠的死亡，說明細(xì)胞外組蛋白是膿毒癥的主要致死性因素。目前仍少有研究關(guān)注膿毒癥患者疾病嚴(yán)重程度和胞外組蛋白濃度之間的關(guān)系。因此，本研究將探討膿毒癥患兒胞外組蛋白水平與膿毒癥嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，并探究組蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞毒性損傷的作用機(jī)制。
1對象與方法
1.1研究對象及分組
2010年1月至2014年12月收集上海兒童醫(yī)學(xué)中心PICU嬰兒膿毒癥病例130例，其中男72例(55.4%)，女58例(44.6%)。發(fā)病年齡為1～12個月，平均年齡4.4個月。根據(jù)膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)分為膿毒癥組(51例)和嚴(yán)重膿毒癥組(79例)，同期兒?？平】刁w檢嬰兒作為對照組(108例)，其中男64例，女44例，年齡1～12個月，平均年齡6.3個月。根據(jù)28d病死率將嚴(yán)重膿毒癥組分為生存組(45例)和死亡組(34例)兩個亞組。膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克、MODS的診斷參照2005年美國胸科醫(yī)師學(xué)會/危重病醫(yī)學(xué)會發(fā)布的擬訂標(biāo)準(zhǔn)[4，5]；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)基礎(chǔ)疾病預(yù)后惡劣，并可能成為患者死亡的主要原因；(2)
惡性腫瘤終末期；(3)自身免疫性疾病。該臨床研究通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心的倫理批準(zhǔn)并簽署了知情同意書。
1.2主要試劑與細(xì)胞
人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)購于美國ATCC公司；組蛋白檢測CellDeathDetectionKit購于美國Roche公司；FITC-抗AnnexinV/PI購于美國BD公司；核因子(nuclearfactor，NF)-κBP65、NF-κBP50、NF-κB抑制因子(IκB)Ba抗體購于CST公司；腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)-α，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6試劑盒購于美國Bio-Rad公司。
1.3方法
1.3.1臨床樣本采集及血清組蛋白檢測
患兒入院或被診斷為膿毒癥后即刻采集外周血1ml，以1500轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速分離8min后吸取上清，保存于－80℃，用于ELISA檢測前置于室溫解凍。胞外組蛋白的檢測按ELISA檢測試劑盒方法[6]，在包備有抗DNA抗體的96孔板加入20μl患兒血漿，在室溫下孵育2h，再加入生物素標(biāo)記的抗組蛋白抗體，在室溫下孵育20min，再利用分光光度計(jì)檢測405nm和490nm的吸光度值。
1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)處理及流式細(xì)胞儀檢測
取對數(shù)生長期HUVEC，按5×105個細(xì)胞接種到6孔板，第2天經(jīng)不同濃度和不同處理時間的小牛胸腺組蛋白(calfthymushistone，CTH)處理后收集細(xì)胞，離心，經(jīng)過處理及AnnexinV/PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞存活率，AnnexinV/PI雙染色陰性細(xì)胞為存活細(xì)胞。不同濃度的CTH：0、50、100、200及300μg/ml，在37℃，5%CO2環(huán)境下孵育1h；不同處理時間的CTH：200μg/ml處理0、5、15、30、45、60min。
1.3.3電鏡標(biāo)本制備
經(jīng)50或200μg/mlCTH孵育HUVEC1h后，用體積分?jǐn)?shù)為4%的戊二醛固定，再經(jīng)脫水、包埋、切片、醋酸鈾-硝酸鉛雙重染色制成超薄切片，在電鏡下觀察組蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。
1.3.4Westernblot檢測NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通路中NF-κB抑制因子IκB以及磷酸化p38/p38表達(dá)
組蛋白孵育HUVEC后，裂解細(xì)胞，經(jīng)Westernblot檢測IκB的蛋白水平以及P38蛋白的磷酸化水平。選取不同孵育濃度(0、50、100及200μg/ml)和200μg/ml下不同處理時間(0、15、30、45、60min)以檢測IκB的蛋白水平以及P38蛋白的磷酸化水平是否與組蛋白的處理時間和劑量相關(guān)。
1.3.5TNF-α和IL-6的檢測
按ELISA檢測試劑盒方法，除空白孔外，加入標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品各100μl至相應(yīng)孔中，37℃孵育60min；洗板后依次加入生物素抗體、酶結(jié)合物100μl/孔，37℃各孵育60min、30min；加顯色劑，避光孵育10～25min；終止液終止，即刻測量OD450值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其濃度。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各指標(biāo)變化的組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1胞外組蛋白水平與膿毒癥的嚴(yán)重程度相關(guān)
嚴(yán)重膿毒癥組患兒血清組蛋白水平(19.17±10.20)顯著高于膿毒癥組(2.29±1.00)及對照組(0.23±0.26)(P<0.001)，見圖1。在嚴(yán)重膿毒癥患兒中，死亡患兒血清組蛋白水平顯著高于存活患兒(29.47±5.99vs.10.94±2.68，P<0.001)，見圖2。
2.2CTH可直接引起血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡，并呈現(xiàn)劑量依賴性和時間依賴性
CTH與內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育，用50μg/ml的CTH處理1h就可以使HUVEC的存活率明顯下降，隨著CTH濃度增加，可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡增加，且呈劑量依賴性(圖3)。200μg/mlCTH處理HUVEC15min就可以使HUVEC的存活率明顯下降，隨著共同孵育時間增加，可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞死亡增加，呈時間依賴性(圖4)。
2.3CTH對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷電鏡觀察結(jié)果
掃描電鏡和透射電鏡都可以觀察到，50μg/ml的CTH即可輕微損傷細(xì)胞膜，200μg/mlCTH孵育HUVEC后，其細(xì)胞膜嚴(yán)重破損(圖5A3中的黑洞，圖5B3中放大的細(xì)胞膜部分)；細(xì)胞核中的染色質(zhì)出現(xiàn)凝集(圖5B3)。
2.4CTH激活NF-κB和MAPK信號通路
如圖6、圖7所示，CTH處理會導(dǎo)致IκB蛋白的降解以及p38磷酸化水平的增加，NF-κB和MAPK通路被激活。并且，IκB蛋白的降解以及p38磷酸化水平的增加呈現(xiàn)CTH處理時間和劑量的依賴性。隨著CTH孵育濃度的增加或處理時間的延長，IκB的蛋白水平逐漸降低，p38磷酸化水平逐漸升高，提示NF-κB和MAPK通路的激活程度增加。但當(dāng)CTH濃度為50μg/ml時，IκB的蛋白水平并未受到影響，提示此濃度還不足以激活NF-κB信號通路。
2.5CTH促進(jìn)HUVEC釋放TNF-α和IL-6
經(jīng)不同濃度的CTH孵育HUVEC后，通過ELISA檢測細(xì)胞上清中的TNF-α和IL-6水平，結(jié)果顯示CTH可促進(jìn)TNF-α和IL-6的釋放(圖8、圖9)。并且，TNF-α和IL-6的釋放呈現(xiàn)劑量依賴性。在50μg/mlCTH處理時，TNF-α的濃度為(137.15±28.16)pg/ml，IL-6為(3.89±0.87)pg/ml；而200μg/mlCTH處理時，TNF-α的濃度為(312.36±32.57)pg/ml，IL-6為(5.81±0.76)pg/ml。
3討論
組蛋白是一種帶有強(qiáng)正電荷的核蛋白，正常的生理功能是在核內(nèi)與DNA相結(jié)合形成核小體，并發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用。但是當(dāng)組蛋白被主動或被動地釋放到細(xì)胞外空間后可以在多個系統(tǒng)或器官中發(fā)揮促炎作用和直接的毒性作用[7，8，9，10]。盡管Xu等[3]的研究表明，胞外組蛋白在膿毒癥小鼠中是致死的關(guān)鍵因素，但是目前尚沒有相關(guān)的臨床研究證明胞外組蛋白與膿毒癥疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膿毒癥患兒的胞外組蛋白較健康兒童有明顯增高，而且其水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。因此，升高的胞外組蛋白水平有可能被用作一種提示膿毒癥疾病進(jìn)展程度和疾病預(yù)后的臨床生物指標(biāo)。膿毒癥的病理生理過程相當(dāng)復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞的激活、炎癥因子的釋放和凝血系統(tǒng)的啟動。膿毒癥疾病進(jìn)展的一個重要受累組織是血管內(nèi)皮。血管內(nèi)皮的完整對于維持血流動力學(xué)正常，防止凝血途徑異常激活和適度的免疫反應(yīng)有著重要作用，而以上三項(xiàng)正是膿毒癥發(fā)展的重要條件[11]，而內(nèi)皮細(xì)胞的活化和功能障礙是膿毒癥發(fā)展惡化的中心環(huán)節(jié)[12，13]。中性粒細(xì)胞激活后形成的胞外誘捕網(wǎng)(neutrophilextracellulartraps)和組蛋白已經(jīng)在體外實(shí)驗(yàn)中多次被證實(shí)對上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞有毒性作用[3，14，15]，但其相關(guān)機(jī)制尚不明。本研究的結(jié)果顯示，組蛋白可以破壞內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜，導(dǎo)致或部分導(dǎo)致細(xì)胞死亡，造成內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。而全身內(nèi)皮細(xì)胞活化可以導(dǎo)致微血管病變，微血管通透性增高，白細(xì)胞黏附和遷移，活性氧家族的活化，血管擴(kuò)張和細(xì)胞因子的產(chǎn)生致使組織乏氧，最終導(dǎo)致器官功能障礙甚至死亡[16]。
此外，本研究顯示組蛋白可以激活HUVEC中的NF-κB及MAPK信號通路，而NF-κB作為參與基因表達(dá)和調(diào)控的一種重要的誘導(dǎo)性核轉(zhuǎn)錄因子，其激活可導(dǎo)致TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)的大量表達(dá)和釋放，這些炎癥介質(zhì)的表達(dá)和釋放又會進(jìn)一步加強(qiáng)炎癥信號通路的激活，促使正反饋環(huán)的形成，最終導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)。而組蛋白損傷內(nèi)皮細(xì)胞后，又進(jìn)一步促使其釋放組蛋白，從而再促進(jìn)中性粒細(xì)胞釋放胞外誘捕網(wǎng)和加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，引起“細(xì)胞因子瀑布”，進(jìn)一步加重膿毒癥的快速進(jìn)展，并引發(fā)多臟器的損傷。
本研究統(tǒng)計(jì)顯示嬰兒膿毒癥或嚴(yán)重膿毒癥患者，往往起病急，進(jìn)展快，多在收入PICU48h內(nèi)給予積極搶救治療后仍無好轉(zhuǎn)死亡。此類患兒如何早期識別和干預(yù)，對改善預(yù)后至關(guān)重要。我們在體外研究中發(fā)現(xiàn)，組蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞毒性作用與劑量及作用時間有關(guān)；同時在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，組蛋白水平與膿毒癥患者的疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)。因此血清組蛋白在一定程度上可以表明疾病的嚴(yán)重程度，早期和連續(xù)檢測可以判別治療的效果。這種變化在生存組與死亡組中的差異亦非常顯著。胞外組蛋白在嚴(yán)重膿毒癥早期即有明顯升高，故可作為嚴(yán)重膿毒癥的早期識別指標(biāo)。
組蛋白作為一種損傷相關(guān)的模式分子可以用于提示組織和臟器的損傷[17]，組蛋白通過破壞內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜和激活NF-κB及MAPK通路放大其組織損傷的程度，這也是組蛋白可能成為治療和控制炎癥反應(yīng)的治療靶點(diǎn)的理論依據(jù)。膿毒癥患兒胞外組蛋白絕對水平與其病死率相關(guān)。因此，危重癥患者合并膿毒癥時檢測血清組蛋白有助于早期診斷、監(jiān)測病情發(fā)展及判斷預(yù)后。及時篩選出重癥患兒，進(jìn)行干預(yù)，阻斷其引發(fā)的瀑布效應(yīng)，阻止膿毒癥的進(jìn)程，降低病死率。
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