微滴式數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)展

　　1、技術(shù)核心原理

　　dPCR核心原理如下：將含有核酸分子的反應(yīng)體系處理為納升級(jí)的微滴，使每個(gè)微滴含或不含待檢靶分子，且每個(gè)微滴都作為一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)器，經(jīng)PCR擴(kuò)增后采用微滴閱讀儀逐個(gè)對(duì)微滴進(jìn)行檢測(cè)，并以終點(diǎn)信號(hào)的有或無(wú)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)（有熒光信號(hào)的微滴判讀為“1”，無(wú)熒光信號(hào)的微滴判讀為“0”）。最后，根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的比例，利用分析軟件計(jì)算待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)，從而獲得最終結(jié)果。

　　域值循環(huán)數(shù)（cyclethreshold，Ct）是實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重要概念，是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和dPCR的原理進(jìn)行比較后可以發(fā)現(xiàn)，dPCR通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理直接給出靶序列的起始濃度，其結(jié)果不再依賴于Ct值[1]，可以避免實(shí)時(shí)熒光定量PCR在低拷貝靶分子、細(xì)微模板濃度差異中靈敏度和精確度相對(duì)較差的缺陷。

　　2、技術(shù)發(fā)展歷史

　　1999年，美國(guó)約翰?霍普金斯大學(xué)Ludwig中心的Kinzler和Vogelstein等[2]通過(guò)純手工操作將直腸癌患者糞便樣品基因組DNA稀釋并等分至384孔微量滴定板的各個(gè)孔中，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增，結(jié)果在超過(guò)100個(gè)孔中發(fā)現(xiàn)了基因組DNA，其中4個(gè)顯示出KAS基因突變。這一研究被認(rèn)為是dPCR理念的開(kāi)端之作。此后，研究人員開(kāi)始從操作簡(jiǎn)化及檢測(cè)便捷等方面對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，并開(kāi)發(fā)出了下列3種樣品分散模式：

　?。?）磁珠模式：主要包括以96孔板、384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體模式，以及利用“小珠、乳濁液、擴(kuò)增、磁性”為主要操作流程的磁珠乳液擴(kuò)增法（Beads，Emulsion，Amplification，Magnetics，BEAMing）。但上述兩種方法無(wú)論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量方面均無(wú)法達(dá)到更加精細(xì)的要求。

　?。?）微滴模式：微滴模式是隨著納米制造技術(shù)（nanofabrication）、微流體技術(shù)（microfluidics），特別是二代測(cè)序技術(shù)發(fā)展起來(lái)的新模式，因此dPCR通常也被稱為“微滴式數(shù)字PCR（dropletdigatilPCR，ddPCR）”。

　　QuantaLife公司最早開(kāi)發(fā)了ddPCR平臺(tái)。2011年，Bio-Rad公司收購(gòu)了QuantaLife公司后更名為QX100?微滴式數(shù)字PCR儀[3]。2013年，升級(jí)為QX200。2012年，RainDance公司推出了Raindrop型號(hào)設(shè)備，這一設(shè)備可以將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割為包含100萬(wàn)至1000萬(wàn)個(gè)皮升級(jí)別微滴的反應(yīng)乳液，從而獲得超高的微滴數(shù)目。

　?。?）芯片模式：1997年，Kalinina等[4]應(yīng)用納升級(jí)芯片進(jìn)行了單克隆模板PCR擴(kuò)增。2013年，LifeTechnologies公司推出了最新型號(hào)的QuantStudioTM3D數(shù)字PCR系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以使樣本均勻分配至2萬(wàn)個(gè)完全單獨(dú)隔離的反應(yīng)孔中，能夠在盡可能簡(jiǎn)化操作步驟的同時(shí)有效防止交叉污染，并有效避免了微滴式系統(tǒng)可能面臨的管路堵塞問(wèn)題[5]。

　　3、數(shù)字PCR的主要應(yīng)用

　　ddPCR具有諸多優(yōu)點(diǎn)[6]，近年關(guān)于以ddPCR為核心技術(shù)平臺(tái)的報(bào)道越來(lái)越多，本文將對(duì)其中幾個(gè)主要領(lǐng)域的應(yīng)用情況進(jìn)行介紹。

　　3.1、突變位點(diǎn)檢測(cè)（mutationdetection）

　　隨著個(gè)體化治療理念的深入推進(jìn)，突變基因檢測(cè)及突變位點(diǎn)癌細(xì)胞比例分析越來(lái)越受到個(gè)體化治療研究人員的重視和關(guān)注。研究表明，循環(huán)腫瘤DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA）是實(shí)體瘤治療效果和預(yù)后評(píng)估的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一，而高篩查能力、多分子檢測(cè)則是ctDNA應(yīng)用于臨床需要迫切解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題[7，8]。2013年，Hindson等[9]在NatureMethod發(fā)表文章，首次將ddPCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR在分析微小RNA（miRNA）表達(dá)水平的重復(fù)性進(jìn)行了系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，證明了ddPCR技術(shù)可于不同情況下準(zhǔn)確、可重復(fù)性地定量檢測(cè)血漿和血清miRNAs，并為miRNAs及其他核酸用于循環(huán)生物標(biāo)志物的檢測(cè)提供了更多依據(jù)。

　　表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）的T790M突變被認(rèn)為是EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosinekinasinhibitor，TKI）耐藥性產(chǎn)生的重要原因。吉非替尼（如易瑞沙）和厄洛替尼（如Tarceva）是TKI的典型代表。多項(xiàng)研究表明，ddPCR在EGFR相關(guān)突變檢測(cè)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[10-13]。Watanabe等[11]利用dPCR建立了一種具有超高檢測(cè)敏感性的EGFR突變檢測(cè)方法。Oxnard等[14]對(duì)9例接受厄洛替尼一線治療的非小細(xì)胞肺癌患者的血漿ctDNA進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，6例患者中檢出T790M突變；隨著治療周期的延長(zhǎng)，突變濃度呈遞增趨勢(shì)，且在時(shí)間上較影像學(xué)確認(rèn)的腫瘤惡化提前了16周。Zheng等[13]利用ddPCR開(kāi)展了一項(xiàng)研究，證實(shí)非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI耐藥患者ctDNA中的EGFRT790M突變是一種不良結(jié)局的預(yù)測(cè)因子[13]。Isobe等[15]也證實(shí)，通過(guò)dPCR可以高效檢出肺腺癌患者癌組織、復(fù)發(fā)腫瘤組織以及血清游離DNA中的T790M突變，且復(fù)發(fā)灶T790M突變陽(yáng)性患者原發(fā)灶突變頻率遠(yuǎn)高于陰性患者。

　　Reid等[16]采用dPCR研究了惡性黑素瘤患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞中BRAF基因V600E和V600K突變，結(jié)果表明，dPCR在靈敏度上高出實(shí)時(shí)熒光定量PCR200倍，檢測(cè)下限為0.0005%，表明dPCR高靈敏度檢測(cè)的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。

　　伊馬替尼是一種BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑，可用于BCR-ABL陽(yáng)性慢性粒細(xì)胞白血病的分子靶向治療。Mori等[17]研究發(fā)現(xiàn)，利用dPCR可以非常有效地預(yù)測(cè)伊馬替尼治療慢性粒細(xì)胞白血病的復(fù)發(fā)率。

　　3.2、基因表達(dá)分析

　　長(zhǎng)期以來(lái)，如何對(duì)多等位基因拷貝數(shù)變異（multi-alleliccopynumbervariation，mCNV）進(jìn)行準(zhǔn)確的遺傳學(xué)分析是困擾科研人員的難題之一。2015年，NatureGenetics報(bào)道了Hand-saker等[18]在這一領(lǐng)域的突破性進(jìn)展，他們通過(guò)全基因組測(cè)序和ddPCR證實(shí)，人與人之間90%已觀察到的基因拷貝數(shù)差異均屬于mCNV。這一研究也從技術(shù)層面證實(shí)，ddPCR是一個(gè)非常有效的、可用于mCNV精確分析的技術(shù)平臺(tái)。

　　因樣本中含有大量PCR反應(yīng)的抑制物及無(wú)法找到合適的定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等原因，石蠟包埋組織、血液、糞便、食品、土壤等樣本的基因分析往往較困難。而dPCR可以完美解決上述問(wèn)題[19-21]。Dingle等[22]系統(tǒng)比較了十二烷基硫酸鈉（sodiumdodcylsulfatesodiumsalt，SDS）、乙二胺四乙酸二鈉及肝素等常見(jiàn)PCR抑制物對(duì)ddPCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的影響，結(jié)果顯示，ddPCR對(duì)SDS和肝素的耐受程度遠(yuǎn)高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。姜羽等[23]、Witwer等[24]、Morisset等[25]研究均證實(shí)，ddPCR的靈敏度、重復(fù)性均優(yōu)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，具有實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。

　　Ferracin等[26]利用Bio-Rad公司的QX200TMddPCR系統(tǒng)，確定了多種癌癥患者的血漿和血清樣本中關(guān)鍵miRNA分子的絕對(duì)水平，他們通過(guò)比較癌癥患者和健康個(gè)體的數(shù)據(jù)證實(shí)miR-181a-5p有望成為乳腺癌的標(biāo)志物。

　　3.3、高通量測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證與深入

　　高通量測(cè)序技術(shù)與ddPCR的聯(lián)合表現(xiàn)在下述兩方面：

　?。?）高通量測(cè)序技術(shù)中樣品制備流程和針對(duì)低含量核酸分子的成單分子測(cè)序?qū)dPCR系統(tǒng)革新具有重要的推動(dòng)作用，這也是ddPCR技術(shù)不斷創(chuàng)新發(fā)展的重要基礎(chǔ)。

　?。?）數(shù)據(jù)量大、可拓展性強(qiáng)是高通量測(cè)序的主要特點(diǎn)，但這也造成后續(xù)結(jié)果分析困難、驗(yàn)證難度大以及假陽(yáng)性率高的缺陷。dPCR對(duì)二代測(cè)序結(jié)果的高性能驗(yàn)證和分析可以為后續(xù)研究的準(zhǔn)確性奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。Boettger等[27]首先通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)人17號(hào)染色體的17q21.31區(qū)域進(jìn)行了深入分析，之后采用dPCR對(duì)結(jié)果進(jìn)行了大樣本量的驗(yàn)證，結(jié)果顯示，dPCR的結(jié)果與高通量測(cè)序數(shù)據(jù)高度吻合，相關(guān)性＞99%。目前，dPCR與高通量測(cè)序、“陣列”聯(lián)用來(lái)進(jìn)行CNV位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)及確認(rèn)已經(jīng)逐步成為一種標(biāo)準(zhǔn)化流程[3]。

　　3.4、病原學(xué)研究

　　ddPCR由于其絕對(duì)定量的特點(diǎn)在病毒的核酸檢測(cè)中也有很好的應(yīng)用前景。

　　“功能性治愈”是人類免疫缺陷病毒/艾滋?。℉IV/AIDS）領(lǐng)域非常重要的臨床概念。2013年，Richman等報(bào)道了一項(xiàng)具有里程碑意義的研究成果：HIV感染患兒出生30小時(shí)后便開(kāi)始接受組合式抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，29天后患兒HIV常規(guī)檢測(cè)結(jié)果呈陰性；隨后，應(yīng)用dPCR技術(shù)分別于出生后第24個(gè)月和第26個(gè)月對(duì)患兒血液中HIVRNA水平進(jìn)行了反復(fù)檢測(cè)，結(jié)果僅能發(fā)現(xiàn)部分HIVRNA片段，未檢測(cè)到具有復(fù)制能力的HIV。在該項(xiàng)研究中，dPCR發(fā)揮了關(guān)鍵作用。目前，dPCR應(yīng)用于HIV相關(guān)核酸檢測(cè)的報(bào)道越來(lái)越多，重點(diǎn)應(yīng)用的仍然是其靈敏度和絕對(duì)定量?jī)煞矫鎇28-30]。

　　乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）慢性感染是導(dǎo)致原發(fā)性肝癌發(fā)生的重要原因。HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）僅存在于被感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，拷貝數(shù)極低，被認(rèn)為是HBV感染慢性化及抗病毒治療停止后復(fù)發(fā)的最主要原因，也是目前HBV藥物研究的核心靶點(diǎn)之一。2015年，Mu等[31]采用基于絕對(duì)定量的dPCR對(duì)HBVcccDNA進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dPCR的檢測(cè)靈敏度可達(dá)單拷貝水平；基于dPCR的核酸檢測(cè)能夠?qū)BVcccDNA實(shí)現(xiàn)靈敏并精確的定量。此外，由于HBV表面抗原突變和低病毒載量等原因，原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本中的HBV相關(guān)研究較為困難。Huang等[32]利用dPCR檢測(cè)了福爾馬林固定后石蠟包埋的肝癌組織標(biāo)本中的HBV特征，結(jié)果證實(shí)，dPCR能夠高效地檢出此類標(biāo)本中的HBVcccDNA，其線性范圍良好，具有很好的研究示范價(jià)值。

　　魏飛力等[33]評(píng)價(jià)了dPCR在HCVRNA定量檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，特別是其對(duì)低拷貝HCVRNA的定量檢測(cè)能力，結(jié)果提示，dPCR在線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度和檢測(cè)靈敏度方面均表現(xiàn)良好。目前臨床檢測(cè)中的HCVRNA定量試劑可以直接應(yīng)用于dPCR中，但其檢測(cè)結(jié)果，特別是極低檢測(cè)下限在臨床中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值尚需進(jìn)一步研究。

　　3.5、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷

　　無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)（noninvasiveprenataltesting，NIPT）是一項(xiàng)非常具有應(yīng)用前景，但目前仍處于嘗試階段的產(chǎn)科診斷平臺(tái)。通常所謂的DNA產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)是指通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)母體外周血漿中的游離胎兒DNA（cell-freefetalDNA，cffDNA）進(jìn)行測(cè)序，再通過(guò)測(cè)序結(jié)果的生物信息分析獲得胎兒遺傳信息的方法。一般認(rèn)為，cffDNA是胎盤(pán)細(xì)胞凋亡的結(jié)果，最早可在妊娠5周時(shí)檢測(cè)到，其濃度隨著孕周增加而增加[34]。

　　由于cffDNA數(shù)量極少，能夠在多少拷貝的水平順利實(shí)現(xiàn)DNA或RNA分子穩(wěn)定檢出是影響其臨床應(yīng)用前景的關(guān)鍵性技術(shù)問(wèn)題。傳統(tǒng)的基因組DNA大多采用商品化的核酸提取試劑盒進(jìn)行。2013年，Holmberg等[35]比較了konniBiosystems公司的TruTip核酸提取技術(shù)和QIAGEN公司的CirculatingNucleicAcids試劑盒對(duì)于cffDNA提取的效果，結(jié)果顯示，TruTip試劑盒對(duì)片段化的cffDNA提取率較QIAGENò試劑盒提高了約87%，且定量PCR結(jié)果與ddPCR結(jié)果相關(guān)性良好。這一結(jié)果也為ddPCR用于產(chǎn)前診斷提供了成功的范例。目前，還有更多的類似研究和應(yīng)用正在開(kāi)展[36]。

　　位于5q13的SMN1基因和SMN2基因是脊髓性肌萎縮（spinalmuscularatrophy，SMA）的致病基因，其中SMN2基因拷貝數(shù)的準(zhǔn)確檢測(cè)是SMA診斷的重要依據(jù)內(nèi)容。Zhong等[37]首先成功應(yīng)用dPCR技術(shù)對(duì)SMA樣本進(jìn)行了SMN2基因拷貝數(shù)的檢測(cè)。Stabley等[38]也利用dPCR技術(shù)開(kāi)展了針對(duì)SMN1和SMN2基因拷貝數(shù)的精確檢測(cè)，結(jié)果提示，該技術(shù)可以精確檢測(cè)0～3拷貝的SMN1基因和0～5拷貝的SMN2基因，且變異系數(shù)分別僅為1.6～3.7%和2.1～2.7%，其檢測(cè)下限和變異度均遠(yuǎn)低于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。Tsui等[39]應(yīng)用dPCR和相對(duì)突變劑量方法對(duì)血友病關(guān)鍵致病基因F8基因或F9基因雜合性突變攜帶孕婦進(jìn)行了研究，結(jié)果提示，dPCR在以血友病為代表的X-連鎖遺傳性疾病檢測(cè)中具有非常好的檢測(cè)性能。此外，dPCR在鐮狀細(xì)胞性貧血和22q11.2微缺失綜合征等疾病診斷方面的研究尚在不斷開(kāi)展和深入過(guò)程中。

　　dPCR作為一項(xiàng)新的技術(shù)，還有許多問(wèn)題需要進(jìn)一步探討，包括技術(shù)本身以及應(yīng)用方面。相信隨著應(yīng)用的深入，ddPCR技術(shù)一定會(huì)以更好的性能在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更多、更好的作用。