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細胞培養(yǎng)時如何減少乳酸積累？

摘要：乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶，存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi)，是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶。通過下調(diào)LDH-A的含量可以有效降低細胞培養(yǎng)過程中乳酸的積累，這點在眾多的文獻中均已得到證實。

CHO細胞是目前用于單抗的生產(chǎn)最廣泛的細胞株，用以培養(yǎng)CHO細胞的培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素等，部分營養(yǎng)物質(zhì)會被轉(zhuǎn)化為細胞毒性的代謝廢物(乳酸、銨等)。銨的積累不僅會影響細胞的生長和蛋白產(chǎn)量，還會改變蛋白的糖基化修飾；同樣，乳酸的產(chǎn)生會降低培養(yǎng)體系的pH，為調(diào)節(jié)pH而添加的堿液及高濃度的乳酸本身導(dǎo)致體系滲透壓的增加，進而影響到細胞成長和蛋白產(chǎn)量與質(zhì)量。筆者在此將促進乳酸代謝的一些策略進行了簡單總結(jié)，可分為基因工程、添加物添加和培養(yǎng)策略改變。

LDH
 
乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶，存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi)，是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶。通過下調(diào)LDH-A的含量可以有效降低細胞培養(yǎng)過程中乳酸的積累，這點在眾多的文獻中均已得到證實。SooMinNoh等在GS篩選體系中運用shRNA技術(shù)構(gòu)建了低表達LDH的細胞株CHO-K1LDHsi、GSKOLDHsi，與對照細胞組CHO-K1、GSKO相比，其乳酸的累積明顯降低，如圖1所示。
 
在此研究中對其他代謝參數(shù)的改變也進行了探討，如銨的積累，基因改造細胞株也較對照組要低些，這可能要歸功于GS篩選系統(tǒng)本身的優(yōu)勢。這種下調(diào)LDH表達量的技術(shù)不會影響到單抗的產(chǎn)量，Soo團隊在對單抗的質(zhì)量屬性分析中發(fā)現(xiàn)LDH下調(diào)對糖基化具有影響，但不會影響到聚體與電荷異質(zhì)性。但其并不推薦在GS系統(tǒng)中實行下調(diào)LDH的基因工程技術(shù)，因其會影響到GS系統(tǒng)的篩選能力。還有一點也是值得注意的，完全的LDH基因去除對CHO細胞是致命的。
 
圖1LDH下調(diào)細胞株CHO-K1LDHsi(白色圓形)、GSKOLDHsi(白色方形)，和其對照CHO-K1(黑色圓形)、GSKO(黑色方形)的乳酸累積比較(來源于參考文獻1)
 
PYC2
 
丙酮酸羧化酶(pyruvatecarboxylase，PYC2)重組表達是哺乳動物細胞中常見的降低乳酸形成的策略，PYC2是糖異生循環(huán)中重要的限速酶，參與將乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油轉(zhuǎn)化生成葡萄糖的催化，因此PYC2在CHO細胞中的高表達可以加速對乳酸的消耗。
 
Toussaint等在CHO細胞中成功構(gòu)建了高表達PYC2的克隆，其團隊將帶有PYC2基因片段的質(zhì)料pTT18嘗試導(dǎo)入129株CHO克隆，從中選取了11株P(guān)YC2-positive克隆進行后續(xù)的實驗。不論是檢測到的乳酸含量、體系的pH變化、又或是細胞VCD和VIA，實驗數(shù)據(jù)均表明PYC2-positive組均較對照組和PYC2-nagetive組消耗了更多的乳酸。同時將這11株P(guān)YC2-positive克隆在5種常用的商業(yè)培養(yǎng)基中進行試驗，得到了相同的實驗結(jié)果，與對照相比其乳酸含量總是較低些。
 
Toussaint團隊還在批培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)中對PYC2-positive克隆(11號克隆)對乳酸降解的情況進行了驗證，結(jié)果如圖2所示。11號克隆的peakVCD幾乎超過對照組的兩倍，后期乳酸也被消耗。值得關(guān)注的是當(dāng)使用11號克隆進行Fed-batch實驗時，乳酸開始消耗時葡萄糖的含量還維持在40mM，即PYC2-positive克隆對乳酸的降解不受葡萄糖濃度的限制。
 
銅離子
 
培養(yǎng)基成分始終是細胞培養(yǎng)中重要的一環(huán)，其中微量元素銅離子曾在多種CHO細胞中被證實可以促進細胞生長及減少乳酸積累。SenXu等在ambr15微反應(yīng)器中進行了相關(guān)實驗，其在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了不同濃度的硫酸銅(1×?200×)，并在D4和D6分別進行了補糖操作。結(jié)果見圖3，通過比較D4和D6補糖后硫酸銅實驗組和對照組間細胞密度與乳酸含量的變化，可知銅離子的添加可促進細胞對乳酸的消耗及細胞生長。
 
究其生化層面的原因，銅離子是細胞色素c重要的輔因子，而細胞色素c參與線粒體膜上電子的傳遞過程，細胞色素c的多寡與銅離子直接相關(guān)。研究表明，線粒體氧化能力降低會造成高濃度的乳酸積累，而銅離子缺失會影響線粒體功能及代謝能力進而擴大乳酸生成路徑。銅離子的加入可能擴大了線粒體的氧化容量，從而降低了乳酸的累積。另外，銅離子添加會影響到單抗的質(zhì)量，如增加堿性峰的比例、降低高甘露糖型水平等。
 
葡萄糖
 
用其他代謝緩慢的糖類代替葡萄糖的策略也是降解乳酸的途徑之一，其中半乳糖是研究較多的一種。用半乳糖、巖藻糖、甘露糖和麥芽糖作為第二碳源對乳酸積累的影響見圖4，除甘露糖外其他糖類的添加均可降低乳酸的積累；當(dāng)以半乳糖代替葡萄糖時細胞活率出現(xiàn)快速下降，這是因為細胞對半乳糖的降解速率緩慢，為避免這種情況可考慮將其他糖類與半乳糖共同使用。
 
低糖消耗乳酸也是細胞培養(yǎng)時常見的策略。早期的一項研究表明，高濃度的葡萄糖會導(dǎo)致高濃度的乳酸積累，限制葡萄糖及谷氨酰胺濃度后乳酸的含量也得到限制，但對于兩者的最低濃度范圍還沒有定論。Yogender等研究了30mM和10mM的葡萄糖對細胞生長和乳酸代謝的影響，其結(jié)果如圖5，雖然低濃度葡萄糖的細胞密度較高濃度葡萄糖低，但其乳酸含量也低些，證明低糖確實有利于乳酸降解。
 
同時，研究員還通過RNA-Seq技術(shù)對CHO細胞中的27629個基因進行了分析，其中10090個基因在兩種不同濃度葡萄培養(yǎng)時表達，而只有575個基因表達量具有區(qū)別。更精確的分析表明，涉及糖酵解、TCA循環(huán)和糖基化的基因在兩種不同濃度葡萄糖時均沒有超過2倍的表達量區(qū)別，也就是說控制低濃度的葡萄糖對單抗的糖基化影響不大。但有研究指出低濃度的葡萄糖會影響糖基化的位點，這可能也與細胞株有很大聯(lián)系。
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