CEP290蛋白位于光感受器的連接纖毛，在外界盤再生和光信號傳傳導中起重要作用。LCA10型患者中CEP290最常見的突變是剪切突變IVS26（c.2991+1655A>G），這一突變對視網(wǎng)膜光感受細胞的影響較大，而對其他體細胞影響輕微，因此臨床表型僅局限于眼部。CEP290包含7.5k個堿基，遠遠超過AAV載體的介導能力，為了克服基因替代療法的局限性，研究者通過視網(wǎng)膜下注射的方法，將AAV5載體介導的金黃葡萄球菌Cas9和CEP290特異向導RNA（gRNAs）導入光感受器細胞內(nèi)，這種gRNAs可以更正原有的IVS26突變，從而正常剪切，得到CEP290的正常表達，并從以下三個方面證明了該方法（EDIT-101）糾正CEP290IVS26突變的有效性。
1.人體成纖維細胞和視網(wǎng)膜組織體外實驗闡明了EDIT-101作用機制，并且證明了核酸酶的特異性。SaCas9和gRNA（EDIT-101）轉染LCA10患者的成纖維細胞后，野生型CEP290mRNA升高，同時突變型CEP290mRNA降低，而且全長的CEP290蛋白表達增加。EDIT-101轉染視網(wǎng)膜組織后，也得到了預期的編輯效果，平均編輯率約為41.7±15.9%。而且這種方法特異性很高，都沒有觀察到脫靶效應，具體如下圖所示：
a.EDIT-101的示意圖；b.基因編輯策略示意圖；c,定量PCRqRT–PCR檢測體外成纖維細胞野生型（藍色）和IVS26突變型（橙色）CEP290mRNA轉錄本；d.人視網(wǎng)膜組織切片的免疫熒光圖片，說明AAV5-hGRK1-GFP體外轉染后，在視網(wǎng)膜組織中可以檢測到GFP的表達。
2.建立CEP290IVS26基因突變敲入小鼠模型，在小鼠模型視網(wǎng)膜下注射EDIT-101，觀察劑量效應和藥代動力學，檢測到迅速并且持久的基因編輯效果，而且總體CEP290基因編輯率與SaCas9mRNA和gRNA均相關。具體結果如下圖所示：
a.不同濃度EDIT-101在小鼠視網(wǎng)膜下注射后不同時間點Cas9mRNA和gRNA的表達；b.不同藥物濃度注射后不同時間點基因編輯的比例；c.CEP290總體基因編輯率和Cas9mRNA(橙色)、gRNA(藍色)的相關性。d.達到有效CEP290編輯的EDIT-101的劑量反應。
3.小鼠缺少黃斑結構，而EDIT-101的設計主要是為了恢復部分視錐細胞功能，因此研究者又設計了用于靈長類動物的EDIT-101類似物（VIR026andVIR067），并在靈長類動物中證明了其對CEP290基因編輯的有效性，達到了治療效果的閾值，表明CRISPR/Cas9技術可以在靈長類動物體細胞中進行有效編輯。
a-d.靈長類動物黃斑旁視網(wǎng)膜下注射VIR607（治療組）或者平衡鹽溶液（對照組）后，SaCas9僅在治療眼的光感受器細胞中表達。
作者還比較了不同濃度劑量的藥物在小鼠和靈長類動物中的基因編輯率，臨床認為基因編輯率>10%即能提高患者的視功能，因此從下表可見當藥物濃度達到1*1012vg/ml時，便可顯著超過臨床治療有效的閾值。
綜上所述，研究者闡明了基因編輯新藥EDIT-101的原理、藥理作用以及耐受性等，為EDIT-101研發(fā)和下一步臨床實驗奠定了基礎。而且這項研究表明EDIT-101在靈長類動物中無明顯免疫反應，并且沒有觀察到脫靶效應，安全性好。這項研究不僅可能造福CEP290相關LCA的患者，而且為其他基因相關的視網(wǎng)膜變性疾病也提供了新思路。
點評
Leber先天性黑矇（LCA）作為一種重要的視網(wǎng)膜變性類疾病，其發(fā)病早、危害重，給社會帶來了沉重負擔。因此也有越來越多的學者關注于相關疾病的研究，其中典型的代表是RPE65相關LCA的基因替代治療，相關藥物LUXTURNA目前在美國已上市而且表現(xiàn)出良好的治療效果。但是視網(wǎng)膜變性類疾病發(fā)病機制復雜，很多疾病并不適合套用基因替代治療，比如本文中提到的CEP290，因其堿基數(shù)目龐大，常規(guī)的病毒載體難以介導正常CEP290基因轉染。但是CEP290基因有突變熱點，因此本文作者有針對性的設計了相應的基因編輯藥物，可以用于治療因此熱點突變導致的視網(wǎng)膜疾病。我們在受此鼓舞的同時必須清晰的認識到，CEP290突變在中國人群中突變率不高，本文提到的熱點突變目前尚未在我國人群中發(fā)現(xiàn)，因此此藥很可能不適用于中國的患者。因此針對遺傳性視網(wǎng)膜疾病，我們需要根據(jù)不用的遺傳背景和機制，來研究相應的治療方法，不能完全照搬國外的技術，需要因地制宜，因病施藥。
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