厭氧菌感染 的檢查：

細菌感染免疫檢測 半飽和氧分壓（P50） 動脈血氧含量（CaO2） 細菌內(nèi)毒素檢查法

　　1.厭氧菌的分離與鑒定

　　(1)標(biāo)本的采集與運送：厭氧菌為人體普遍存在的正常菌群，尤多見于腔道口黏膜組織，因此標(biāo)本采集過程中應(yīng)避免為正常菌群所污染。標(biāo)本應(yīng)從正常無菌部位或通過嚴(yán)格無菌操作采取，如血液、胸腹腔液、心包液、腦脊液、關(guān)節(jié)液，以及通過外科無菌手術(shù)抽得的膿液;或通過特殊技術(shù)，如經(jīng)纖維支氣管鏡取得的下呼吸道標(biāo)本、由陰道后穹隆抽出的盆腔膿液等標(biāo)本均不接觸正常菌群，因而都屬合格的標(biāo)本。至于口腔和鼻咽拭子、肛拭和陰道拭子、胃與小腸內(nèi)容物、咳出的痰液、未經(jīng)局部消毒而排出的尿、流出的膿等標(biāo)本一般不作厭氧培養(yǎng)，因已有污染可能，檢出結(jié)果無參考意義。為避免接觸正常菌群，不同部位的標(biāo)本有特殊的采集方法;肺部感染痰液標(biāo)本，在有經(jīng)驗者以經(jīng)氣管直接穿刺抽取較為可靠，但在嚴(yán)重缺氧，有出血傾向和劇咳的患者禁忌;尿液標(biāo)本以經(jīng)皮膚從恥骨上穿刺取得為可靠，但此法臨床難以推廣，目前仍以清潔中段尿為主;女性生殖道感染標(biāo)本收集時應(yīng)先清潔消毒陰道和宮頸，小心擴張宮頸口，然后以外套消毒指套的針筒或無菌塑料套管伸入宮頸管或?qū)m頸內(nèi)吸出分泌物，或可作子宮直腸窩穿刺，可得未污染的標(biāo)本;鼻竇、其他竇道或深傷口等，可在皮膚消毒后，用空針連著導(dǎo)管盡可能深入抽取。懷疑有敗血癥者，應(yīng)在用抗菌治療前短期內(nèi)采血2～3次，采血量多，陽性率高，一般血液與培養(yǎng)液的比例以1∶10～1∶20為宜;抗凝劑以選擇多聚茴香磺酸鈉為宜，因其具有抗補體、抑制血液正常殺菌活力和白細胞吞噬活性，可使細菌生長迅速，陽性率提高。此外用溶血離心法處理血標(biāo)本亦可顯著提高培養(yǎng)率。且提早出結(jié)果。標(biāo)本采集后應(yīng)盡量不接觸空氣，標(biāo)本運送可采用下列方法：①針筒運送法：用于運送各種液體標(biāo)本，用無菌針筒抽取標(biāo)本后，排出多余的空氣，針尖插入無菌橡皮塞、隔絕空氣，運送至實驗室;②無氧小瓶運送法：通常用以運送少量膿液，以無菌青霉素小瓶采樣，瓶內(nèi)裝培養(yǎng)基0.5ml，加少量亞甲藍或刃天青(resazurin)作為氧化還原指示劑，加蓋密封；③大量液體標(biāo)本運送法：裝滿標(biāo)本瓶，即可驅(qū)除瓶中空氣，加蓋密封運送；③大量液體標(biāo)本運送法：裝滿標(biāo)本瓶，即可驅(qū)除瓶中空氣，加蓋密封運送;④組織塊運送法：組織塊置密閉厭氧罐中運送，罐內(nèi)放入一團以酸化硫酸銅浸泡處理過的鋼絲羢以吸氧;⑤厭氧菌培養(yǎng)袋運送法：患者標(biāo)本床旁接種于預(yù)還原厭氧滅菌培養(yǎng)基，然后將平板放入?yún)捬醮羞\送。棉拭子最好勿用，如系棉簽采集的標(biāo)本，應(yīng)直接將之插入預(yù)還原培養(yǎng)基如硫乙醇酸鈉(THIO)培養(yǎng)基中洗出，擠干，將洗出懸液再按上述吸出物(抽出物)接種培養(yǎng)基即可。

　　(2)培養(yǎng)：培養(yǎng)基于接種前必須處于無氧狀態(tài)。為達到此目的，可：①初代培養(yǎng)用的平板應(yīng)新鮮配制，4h內(nèi)用完;或放人充以二氧化碳的不透氣密封塑料袋中，4℃保存，1～2天內(nèi)用完;②用前放入無氧環(huán)境，使預(yù)還原24～48h;③用預(yù)還原厭氧滅菌法配制的培養(yǎng)基，即在整個配制和分裝過程中均通入二氧化碳，使培養(yǎng)基不接觸氧;④液體培養(yǎng)基使用前煮沸10mm。驅(qū)除溶解其中的氧氣，迅速冷卻后立即接種。非選擇性培養(yǎng)基：目前最常用者為牛心腦浸出液和布氏菌肉湯兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入氯化血紅素5μ/ml、維生素K110μg/ml、0.5%酵母浸出液、5%～10%羊血等制成血平皿，分別為BHIB和BRU，幾能培養(yǎng)出所有厭氧菌。原上海醫(yī)科大學(xué)與上海生物制品研究所合作試制的厭氧菌干燥培養(yǎng)基，經(jīng)廣泛應(yīng)用，效果良好。選擇性培養(yǎng)基：利用選擇性培養(yǎng)基，可在眾多的細菌中，選出主要的致病菌，可根據(jù)標(biāo)本的來源，選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基。目前常用的選擇性培養(yǎng)基有：①卡那霉素-萬古霉素溶血平皿(KVLB)?？梢种贫鄶?shù)兼性厭氧菌，使產(chǎn)黑素普氏菌早期形成黑色素;如用于選擇卟啉單胞菌屬，萬古霉素的濃度以2ng/ml或以下為宜(原配方中的濃度為7.5ng/m1);②類桿菌膽汁七葉苷瓊脂(BBE)，脆弱類桿菌組細菌和死亡梭桿菌能耐膽汁，并能水解七葉靈，使培養(yǎng)基呈黑色，菌落周圍有黑暈;③卵黃瓊脂(EYA)，用于選擇產(chǎn)氣莢膜梭菌;④苯乙醇血瓊脂(PEA)，抑制變形桿菌和其他腸桿菌科細菌，有利于厭氧菌的生長;⑤環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂(CCFA)，選擇艱難梭菌;⑥改良Fm培養(yǎng)基，選擇梭桿菌;⑦乳酸鈉培養(yǎng)基，選擇韋榮球菌等。在標(biāo)本接種前，如能先進行直接涂片染色鏡檢，以了解細菌的形態(tài)和染色性，初步估計標(biāo)本中的可能細菌，再選用培養(yǎng)基將更具針對性。厭氧菌中的放線菌屬、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬和消化鏈球菌屬等都有不少菌種或菌株為微需氧菌，通過用同一菌落分別在有氧、無氧或5%～10%二氧化碳環(huán)境中進行培養(yǎng)的耐氧試驗(aerotolerance test)，可測出各種細菌對氧的需求，而命名為需氧、厭氧、微需氧等不同類型的細菌。厭氧菌接種后應(yīng)放入?yún)捬跖囵B(yǎng)裝置和儀器以維持厭氧環(huán)境。目前臨床常用的厭氧培養(yǎng)裝置有厭氧培養(yǎng)罐(anaerobic jar)，或厭氧缸、厭氧袋和厭氧箱或厭氧室(chamber)三種系統(tǒng)，三者對臨床常見厭氧菌的檢出率基本相同，但以厭氧培養(yǎng)罐最簡便實用，厭氧培養(yǎng)罐可用泵抽氣充氣或化學(xué)方法去除操作環(huán)境中的游離氧，而以N2(80%)，CO2(10%)、H2(10%)取代，建立厭氧環(huán)境。H2在催化劑(氧化鈀)存在的情況下，可與殘留的氧化合而形成水。罐中可放亞甲藍作指示劑。接種后的培養(yǎng)基置厭氧環(huán)境中孵育，48h后進行初次檢查。如無生長繼續(xù)孵育，同時再接種一平皿進行孵育，兩者均無生長者作為陰性，故培養(yǎng)一般需1周以上才能作出結(jié)論。

　　(3)鑒定：厭氧菌的常規(guī)鑒定包括菌落形態(tài)、溶血性、色素產(chǎn)生、經(jīng)紫外線照射有無熒光現(xiàn)象、菌落涂片、染色和鏡檢、生化反應(yīng)、動力、毒力試驗等;其中糖發(fā)酵試驗為基本的生化反應(yīng)，常規(guī)采用試管法，培養(yǎng)基用量大，需時長，目前已發(fā)展微量、快速、商品化的鑒定系統(tǒng)。國外有專供厭氧菌鑒定的多種檢測系統(tǒng)和快速鑒定系統(tǒng)，使厭氧菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)化，并可與微機聯(lián)用逐步自動化。已有下列幾種鑒定系統(tǒng)：①推斷性平皿(presumpto plates)：是由美國CDC實驗室Lombard與Dowell兩學(xué)者設(shè)計制成，故亦稱LD瓊脂，乃將多種試驗集合制成專門比的平皿培養(yǎng)基，稱為推斷性平皿(pp)，pp共有pp1、pp2、pp3三種。每一種平皿劃分為四個區(qū)、三個平皿共12個區(qū)(包括pp1的LD瓊脂和七葉苷、卵黃與膽汁，pp2的DNA、葡萄糖、牛乳與淀粉。以及pp3的甘露醇、乳糖、鼠李糖與明膠等瓊脂)可測定厭氧菌的18種不同特性。純培養(yǎng)接種于pp后需在厭氧環(huán)境下孵育48h后觀察結(jié)果，對照厭氧菌的分類特征，和該商品所提供的鑒定表格可作出推斷性鑒定。②生化微量鑒定系統(tǒng)(biochemical-based minisystem)：其所進行的試驗與常規(guī)檢驗系統(tǒng)測試者大多相同。但制成小形塑料條或盤。例如APl20A即為一塑料長盒，內(nèi)有20個，內(nèi)置試劑用以檢測細菌的吲哚生成、觸酶、尿素酶、七葉苷水解、明膠液化和對16種糖的發(fā)酵活力;使用本系統(tǒng)時，細菌混懸液加入內(nèi)后需置厭氧環(huán)境中孵育24～48h，觀察結(jié)果，讀數(shù)可查對生產(chǎn)者提供的電碼本。③細菌已形成酶活性的微量鑒定系統(tǒng)(pre-existing enzyme-based minisystem)，采用小形塑料板或卡。細菌已形成的酶與微量基質(zhì)(酶作用物)作用后能發(fā)生迅速反應(yīng)，菌液加入板上的內(nèi)后無須置厭氧環(huán)境孵育，4h即可觀察結(jié)果，已有AN-IDENT(21種試驗)、Rapid ANAAⅡ(18種試驗)、Microscan(24種試驗)等系統(tǒng)生產(chǎn)。

　　2.氣相色譜分析 主要包括細菌代謝產(chǎn)物和細胞成分的分析。

　　(1)厭氧菌代謝產(chǎn)物的氣相色譜分析：厭氧菌的特點之一為代謝過程中產(chǎn)生各種揮發(fā)性和非揮發(fā)性短鏈脂肪酸以及醇類產(chǎn)物。不同菌屬與菌種所產(chǎn)生脂肪酸、醇的種類和數(shù)量不同，因此可用氣相色譜分析鑒定。厭氧菌產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸有醋酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、異己酸等;非揮發(fā)性脂肪酸有丙酮酸、乳酸、琥珀酸等，不能直接進行氣相色譜分析，必須先用甲醇或三氟乙硼等酯化，生成甲基衍生物再行氯仿提取進行氣相色譜分析。臨床標(biāo)本(如膿液等)中也可有脂肪酸累積，故可以乙醚或氯仿提取制譜分析，在收到標(biāo)本1h內(nèi)即可作出有無厭氧菌的初步診斷，但為確診是何種厭氧菌必須作進一步鑒定。

　　(2)厭氧細胞成分的氣相色譜分析：將細菌細胞皂化釋出脂肪酸，加入甲醇甲基化后進行氣相色譜分析，鑒定結(jié)果客觀，重復(fù)性好。

　　3.免疫學(xué)檢查及其他 熒光抗體技術(shù)(包括直接和間接)能成功地識別各種厭氧菌(如類桿菌、梭菌、梭形桿菌、短棒菌苗等)。臨床厭氧菌感染中，致病菌以脆弱類桿菌(Bf)最為常見。國外雖有熒光抗體商品，但價格昂貴。國內(nèi)學(xué)者從分離得的Bf中，精篩出一株Bf，制備得高價免疫血清，以熒光標(biāo)記后，檢測Bf，陽性率達100%，而非Bf菌熒光抗體染色均為陰性;此外亦進行了間接免疫熒光法用于診斷產(chǎn)氣莢膜梭菌(Cp)、Bf、產(chǎn)黑素普氏菌、核梭桿菌等感染的研究，并與細菌培養(yǎng)法比較，兩者的符合率相當(dāng)高;用免疫酶標(biāo)組化診斷Cp，與培養(yǎng)法和熒光抗體染色法的結(jié)果進行比較，三者的陽性率基本一致，有快速診斷價值;用酶標(biāo)抗體直接染色快速診斷牙周病，與培養(yǎng)法比較，符合率在90%以上，方法簡便、實用。國內(nèi)亦已開始應(yīng)用Bf DNA探針于臨床，其敏感性為89.8%，特異性為97.3%。基因擴增技術(shù)亦已用于診斷研究。